Schutzpeptid gegen Gewebeschäden

Viele Erkrankungen stehen im Zusammenhang mit der Aktivierung von programmierten Zelltodprozessen. Obwohl die wichtigsten mitochondrialen Signalwege aufgeklärt wurden, bleibt die Entwicklung therapeutischer Strategien eine Herausforderung. Eingriffe in späte Stadien der Apoptose über die Hemmung von Caspasen sowie der Nekrose über die Hemmung der mitchondrialen Poren (mPTP)-Bildung waren in klinischen Studien bisher nicht erfolgreich – möglicherweise aufgrund von irreversiblen Mitochondrienschäden. 

Alternative Targets sind apoptotische Signalwege, die stromaufwärts liegen und über das Schicksal der Mitochondrien entscheiden, wie die BCL-2-Proteinfamilie (B-Zell-Lymphom-2) mit den zentralen Steuerungselementen BAX und BAK1. Das Eindringen von BAX und BAK1 in die äußere Mitochondrienmembran (MOM) führt zu irreversiblen Schäden und zur Freisetzung von Apoptose-induzierenden Faktoren, die wiederum Caspasen aktivieren und die Endphase der Apoptose einleiten. Darüber hinaus werden BAX und BAK1 mit Nekrose bei Ischämie-bedingten Reperfusionsschäden in Verbindung gebracht. BAX und BAK1 werden durch BH3-only-Proteine aktiviert, die ebenfalls zur BCL-2-Familie gehören. BNIP3 ist ein atypisches BH3-only-Protein, das mitochondriale Schäden und den apoptotischen als auch den mPTP-gesteuerten Zelltod induziert. 

In dieser Arbeit wurde auf Basis der Interaktionen von BNIP3 mit BAX ein Antagonisten-Peptid entwickelt und dessen Wirksamkeit und Sicherheit im Tiermodell untersucht.¹

Zunächst wurde in Mausfibroblasten durch Proximity Ligation Assays bestätigt, dass BNIP3 in intakten Zellen mit BAX und BAK1 interagiert. Anhand einer Bibliothek aus 13 BAX-Peptiden, immobilisiert auf Mikroarrays, wurden potenzielle Interaktionsstellen mit BNIP3 identifiziert. Durch Zirkulardichroismus-Spektroskopie und Computer-Modellierungen erfolgte der Nachweis der N-terminalen Region von BNIP3 als zentrale Interaktionsstelle, insbesondere der ersten 20 Aminosäuren. Eine BNIP3-Mutante ohne N-Terminus zeigte zudem verminderte Apoptose-Aktivität. Daher wurde ein Peptid der N-terminalen 49 Aminosäuren von BNIP3 synthetisiert, das zur BAX-Aktivierung fähig war (Nachweis über einen etablierten BAX-Aktivitätstest). 

Bei der Aktivierung des BAX-Proteins erfolgt eine Konformitätsänderung in 2 Schritten, wodurch die Porenbildung in der Mitochondrienmembran mit anschließender Freisetzung von Cytochrom c eingeleitet wird – der entscheidende Schritt der mitochondrialen Apoptose. Die initiale BAX-Aktivierung, die über eine Antikörper-Bindung nachweisbar ist, erfolgte durch das BNIP3-Peptid – in vergleichbarer Weise zu anderen bekannten BAX-Aktivatoren. Im zweiten Schritt der BAX-Aktivierung wird eine α-Helix freigelegt, deren Transmembrandomäne die BAX-Insertion in die äußere Mitochondrienmembran (MOM) ermöglicht. Aufgrund der hydrophoben Natur ist eine Antikörper-Bindung nicht möglich. Die Membraninsertion von BAX wurde daher nachgewiesen, indem Herzmitochondrien mit BAX und BNIP3-Peptid inkubiert und nach alkalischer Extraktion einer Western-Blot-Analyse unterzogen wurden. Demzufolge förderte das BNIP3-Peptid auch die MOM-Insertion von BAX.

Anschließend wurden die interagierenden Aminosäuren des BNIP3-Peptids durch Protein-Peptid-Mikroarrays weiter eingegrenzt. Experimente mit 47 verkürzten Peptiden ergaben, dass 8 Aminosäuren an der Position 13–20 (WVELHFSN) die BAX-Aktivierung um den Faktor 14 verstärkten gegenüber dem nicht-verkürzten Peptid. Der Austausch jeder Aminosäure durch 20 natürliche Aminosäuren ergab, dass die S19F-Substitution von Serin (S) durch Phenylalanin (F) an Position 19 die Bindung an BAX verstärkte. Weiteren Strukturmodellierungen und Bindungsmessungen zufolge zeigte das mutierte Peptid eine höhere Affinität zu BAX als das Wildtyp-Peptid.

Das aus den Aminosäuren WVELHFFN bestehende mutierte Peptid wurde mit der Transportsequenz des HIV-1-TAT-Proteins fusioniert, um Löslichkeit und Membrangängigkeit zu erhöhen und als B-017 bezeichnet. In Wildtyp-Zellen (Maus und Mensch), die mit dem Apoptose-induzierenden Wirkstoff Staurosporin inkubiert wurden, hemmte B-017 sowohl die initiale Aktivierung als auch die MOM-Insertion von BAX. Zusätzlich inhibierte B-017 die Aktivierung von BAK1 und zeigte auch in BAX-BAK-defizienten Zellen eine gewisse protektive Wirksamkeit gegen Apoptose. In Zellen, die mit Staurosporin und Doxorubicin behandelt sowie Hypoxie/Reoxygenierung ausgesetzt wurden, wies B-017 antinekrotische Eigenschaften auf durch Hemmung von:

• Caspase-3/7-Aktivität
• ROS-Bildung
• Ca²⁺-Überladung der Mitochondrien
• mPTP-Bildung 

Die Titration von fluoreszenzmarkiertem B-017 mit Proteinen der BCL-2-Familie ergab eine 4-fach geringere Affinität für die strukturverwandten Proteine BCL-2 und MCL-1 gegenüber BAX, aber dagegen war keine Bindung von B-017 an das nicht verwandte Protein Glutathion-S-Transferase nachweisbar. Toxizitätsstudien mit weiblichen und männlichen Ratten lieferten ein günstiges Sicherheitsprofil, ohne Veränderungen von Serumchemie, Urinparametern sowie von Gewebe oder Organen, einschließlich Herz, Leber und Gehirn. Behandlungsbedingte Ereignisse beschränkten sich auf die Injektionsstelle und umfassten subkutane Blutungen, Entzündungen sowie Nekrosen der Haut, des Unterhautgewebes und der darunterliegenden Muskulatur, die sich in der Erholungsphase zurückbildeten.

Nach einem Myokardinfarkt führen Ischämie und Reperfusion zu Schäden, wobei die Mitochondrien für den Tod der Kardiomyozyten durch Nekrose und Apoptose verantwortlich sind. Die protektiven Effekte von B-017 wurden in Mäusen nach Herzinfarkt untersucht, denen 5 Minuten vor der Reperfusion B-017 in die LV-Höhle injiziert wurde. B-017 verringerte die Infarktgröße 24 Stunden nach der Reperfusion dosisabhängig um 40 % im Vergleich zum Kontrollpeptid. Im katheterbasierten Myokardinfarktmodell von Schweinen, die 5 Minuten vor der Reperfusion B-017 als intravenöse Bolusinjektion in die Oberschenkelvene erhielten, wurde die Infarktgröße sogar um 60 % reduziert.  

Die Behandlung mit B-017 bewirkte bei Mäusen eine Erholung der LVEF bis Tag 3 nach Reperfusion gegenüber der Kontrollgruppe. Dehnungsanalysen als sensibles Instrument zum Nachweis regionaler Veränderungen zeigten eine signifikante Verbesserung der globalen longitudinalen, zirkumferentiellen und radialen Dehnung im Vergleich zur Kontrollgruppe (GLS −10 % vs. −6 %, GCS −22 % vs.−10 %, GRS 35 % vs. 12 %). Um den Schutz von B-017 vor Herzinsuffizienz zu untersuchen, erhielten Mäuse intraperitoneal B-017 an den Tagen 1, 3, 5 und 7 nach Reperfusion. Bereits am Tag 3 trat eine Verbesserung der LVEF ein, die sich bis zum Tag 28 vollständig erholte, während die Kontrollgruppen keine Veränderung der LVEF aufwiesen.

Zusätzlich bewirkte die Behandlung mit B-017 eine Reduktion folgende apoptotischer und nekrotischer Marker:

• Troponin-Spiegel
• BAX in Mitochondrien (gebundene und insertierte Formen)
• Cytochrom-c-Freisetzung
• Caspase-Aktivität 

Eine umfassende metabolomische Analyse der Herzen nach 60 Minuten Reperfusion mit Schwerpunkt auf Glykolyse, Tricarbonsäurezyklus (TCA-Zyklus) und Aminosäurestoffwechsel ergab, dass B-017 sowohl die Zwischenprodukte des TCA-Zyklus wie Succinat, Fumarat und Malat als auch die Prolin-, Serin- und Asparagin-Spiegel erhöhte. Der Anstieg der TCA-Zyklus-Metabolite und Aminosäurespiegel könnte eine kompensatorische Stoffwechselreaktion widerspiegeln, die zur Erhaltung der kontraktilen Funktion beiträgt.

Bei Mäusen mit einem induzierten ischämischen Schlaganfall reduzierte intravenös verabreichtes B-017 die Infarktgröße um 52 % und verbesserte neurologische Ausfälle (Bederson-Score). Die Wirkung von B-017 bei Organtransplantationen wurden anhand von ischämisch gelagerten Rattenlebern überprüft, was ein etabliertes Reperfusionsmodell darstellt. B-017 verringerte die Gewebeschädigung nach 120 min Reperfusion deutlich, verbesserte die Alanin-Transaminase und Aspartat-Aminotransferase und förderte die funktionelle Erholung.

Zusammenfassend zeigten die Daten, dass die BNIP3-BAX/BAK1-Achse ein entscheidender Hauptschalter der mitochondriengesteuerten Apoptose und Nekrose ist. Das durch Reverse Engineering entwickelte Schutzpeptid B-017 ist ein hochwirksamer Modulator dieser Achse. Aufgrund der hohen Spezifität und des günstigen Sicherheitsprofils könnte B-017 eine Behandlungsoption zur Vermeidung von Reperfusionsschäden darstellen, wie beispielsweise nach Myokardinfarkt, Schlaganfall oder bei der Organtransplantation.

Für die Kardioprotektion bei Ischämie/Reperfusion existiert eine lange Liste gescheiterter Translationen. Zum Beispiel Caspase-Inhibitoren und die Hemmung der mPTP-Öffnung – etwa mit Cyclosporin A – konnten den experimentellen Erfolg klinisch nicht bestätigen. Eine plausible Erklärung ist, dass diese Strategien zu spät in den relevanten Signalwegen ansetzen. Ist die äußere Mitochondrienmembran erst permeabilisiert, ist der Schaden irreversibel. Genau hier liegt die konzeptionelle Stärke der Arbeit des Teams von Ulrike Hendgen-Cotta und Tienush Rassaf. Mit der BNIP3–BAX/BAK1-Achse wird ein Schalter oberhalb dieses „Point of no Return“ adressiert.

Bemerkenswert ist der gewählte methodische Weg. Aus der Strukturanalyse des BNIP3-N-Terminus wurde eine minimale Interaktionssequenz eingegrenzt, systematisch mutiert und zu einem Antagonisten mit höherer BAX-Affinität weiterentwickelt. Aus einem Aktivator wird ein Inhibitor – das ist sauberes Reverse Engineering und kein Screening-Zufallstreffer. Überzeugend ist zudem die Breite der In-vivo-Validierung: Infarktgrößenreduktion i) in der Maus, ii) im katheterbasierten Schweinemodell nach intravenöser Bolusgabe, iii) im Schlaganfallmodell sowie iv) in der ischämisch gelagerten Rattenleber. Das Applikationsfenster – wenige Minuten vor Reperfusion – ist im STEMI-Setting realistisch, weil der Reperfusionszeitpunkt im Herzkatheterlabor bekannt ist.

Was diese Arbeit von früheren Kardioprotektionsansätzen ebenfalls unterscheidet, ist die Konsistenz der Befunde über die Ebenen hinweg. Der Effekt zeigt sich nicht nur an der Infarktgröße, sondern auch funktionell. Die Erholung der LVEF und die Verbesserung der globalen ventrikulären Deformation nach Reperfusion sprechen für einen relevanten myokardialen Nutzen und nicht für ein rein histologisches Signal. Die Effekte sind zudem mechanistisch nachvollziehbar, denn reduzierte BAX-Insertion, geringere Cytochrom-c-Freisetzung, niedrigere Caspase-Aktivität und Troponinwerte bilden eine schlüssige Kette. Dass die Substanz auch im Gehirn und in der Leber schützt, spricht für ein speziesübergreifend konserviertes Wirkprinzip. Die Toxikologie an Ratten ergab bislang ein günstiges Sicherheitsprofil und die intravenöse Bolusgabe im Großtiermodell entspricht bereits der Applikationsform, die im Herzkatheterlabor praktikabel sein könnte. Damit scheinen wesentliche Voraussetzungen für eine klinische Weiterentwicklung erfüllt.

Für die klinische Kardiologie bleibt der Reperfusionsschaden eine der großen ungelösten Fragen. Diese Arbeit liefert kein fertiges Medikament, aber eine mechanistisch gut begründete Substanzklasse mit plausiblem Angriffspunkt und in mehreren Spezies reproduziertem Effekt. Das rechtfertigt die Weiterentwicklung in der Klinik. Ob daraus wirklich eine neue Therapie werden kann, entscheiden dann randomisierte und kontrollierte Studien am Menschen.