Zebrafisch-Modell für RBM20-mediierte dilatative Kardiomyopathie: Wirkung von RBM20 auf die PEVK-Domäne des Titins sowie phänotypische Untersuchung nach Morpholino-induziertem RBM20 Knock-down

Einleitung
Die dilatative Kardiomyopathie (DCM) ist eine Erkrankung des Herzmuskels, bei der eine linksventrikuläre Dilatation und eine systolische Dysfunktion vorliegt, die anderweitig (bspw. durch eine koronare Herzkrankheit) nicht erklärbar ist. Eine mögliche genetische Ursache ist eine Mutation im Gen des RNA Binding Motif Protein 20 (RBM20), welche mit einem hohen Risiko für einen plötzlichen Herztod einhergeht (ca. 3-5%/Jahr). RBM20 beeinflusst das Spleißen von Titin, das mit seiner federartigen Wirkung die Kontraktion des Herzmuskels durch Aufbau einer passiven Spannung während der Diastole unterstützt. Bei einer relevanten Mutation des RBM20 kann die Federwirkung des Titins eingeschränkt sein und so zu einer DCM führen. Im Rahmen einer heterozygoten Mutation wäre denkbar das intakte RBM20 zu beeinflussen und somit ein Therapieansatz gegeben.
Um die Basis dafür zu legen, bieten sich Zebrafische (danio rerio) als Tiermodell an.
Es wurde die Vergleichbarkeit von humanem RBM20 und das des Zebrafisches in Bezug auf die Spleißeigenschaften mit Hilfe eines Reporter-Minigens auf Titin ermittelt sowie der Phänotyp von RMB20 knock-down Zebrafischen und die Integration des Minigens in das Zebrafisch-Genom analysiert.

Methoden
Für den Vergleich des menschlichen mit dem Zebrafisch-RBM20 wurde das bereits etablierte Minigen der PEVK-Domäne von Titin benutzt, das die Effektivität des Spleißens von Titin in vitro mittels zwei in die Domäne integrierter Luziferasen ermittelt. Durch funktionsfähiges RBM20 wird eine der beiden Luziferasen entfernt, bei nicht funktionsfähigem RBM20 verbleiben beide Luziferase im Transkript. So können die Signalintensitäten verglichen und die Spleißaktivität von RBM20 beurteilt werden.
Um den DCM-Phänotyp beim RBM20-kompromittierten Zebrafisch zu analysieren, wurde mittels Morpholino ein knock down erstellt. Das Morpholino blockiert dabei das Spleißen von RBM20 an einem Intron-Exon-Übergang und führt somit zu einer Frameshiftmutation und einem nicht-funktionellen RBM20.

Ergebnisse
In der Auswertung zeigte sich, dass sowohl das menschliche wie auch das RBM20 des Zebrafisches die PEVK-Domäne des Titins spleißen, funktionell also eine Vergleichbarkeit gegeben ist. Anzumerken ist jedoch, dass das Zebrafisch-RBM20 eine Spleißeffektivität von 60% besitzt, das humane hingegen 80%.
Der Phänotyp der MO-behandelten Fische wies primär ein kardiales Ödem und eine unspezifische Krümmung des Körpers auf. In nachfolgenden Gelelektrophoresen und Sequenzierungen konnte die Blockierung des Spleißens von RBM20, und somit dessen Funktionsbeeinträchtigung, jedoch eindeutig nachgewiesen werden.

Diskussion
Die nachgewiesene Fähigkeit des RBM20 des Zebrafischs vergleichbar zum humanen zu wirken, legt nah diesen Spleißfaktor am genannten Tiermodell weiter zu untersuchen. Einschränkend ist dabei, dass dieses nur für eine Domäne des Titins gezeigt wurde und noch andere zentral für die regelrechte Funktion des Proteins sind.
Die Auffälligkeiten des Phänotyps nach MO-Behandlung sind äußerst unspezifisch. Des Weiteren beruhen die Ergebnisse auf subjektiven, makroskopischen Einschätzungen und sind bisher nicht weiter objektiviert. Da im Menschen eine Defizienz von RBM20 erst im erwachsenen Alter klinische und echokardiographische Auffälligkeiten zeigt, kann eine ähnliche Entwicklung in Zebrafischen postuliert werden. Es bedarf weiterer Forschung, um möglicherweise dezidierte Ergebnisse zu erzielen.