https://doi.org/10.1007/s00392-024-02526-y
1Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf Klinik für Herz- und Gefäßchirurgie Universitäres Herzzentrum Hamburg, Deutschland
Überblick
hiPSCs scheinen eine vielversprechende Zellquelle für die Regenerative Medizin zu sein, insbesondere für die kardiale Ersatztherapie (Kardiales Tissue Engineering). Es bestehen jedoch Bedenken hinsichtlich der biologischen Sicherheit im Zusammenhang mit der Auswaschung von Zellen mit potenziell teratogenem Potenzial in den Empfängern nach der Injektion von hiPS-Kardiomyozyten (hiPS-KMs) und der Transplantation von künstlichem Herzgewebe (EHT). Um diese Zellen aufzuspüren, wurden hiPSCs mit einem lentiviralen Knock-in mit dem Reporterenzym Luciferase transduziert, das nach Zugabe des Substrates D-Luciferin in der Lage ist Photonen zu emittieren. Die Detektion Luciferase positiver Zellen, d.h. von photonen-emittierenden Zellen, erfolgte mittels Biolumineszenz-Imaging (BLI).
Methoden
Die hiPSCs wurden mittels eines lentiviralen Vektors mit dem Reporterenzym Luciferase transduziert. Luc+ hiPS-KMs wurden durch spezifische Modulation des Wnt/beta-Catenin-Weges aus hiPS-Zellen differenziert und für die Herstellung von EHTs verwendet. Zur Funktionsprüfung der EHTs wurden mithilfe video-optischer Analysen Kontraktionsprofile erstellt. Zur Testung der Empfindlichkeit des BLI und um die Funktionalität des Enzyms zu validieren, wurden die KMs und EHTs in 2D-Kultur in verschiedenen Verdünnungsreihen validiert und auf ihre Qualität hin untersucht. Um die Abschirmung verschiedener Organe und anatomischer Strukturen zu testen, wurden die KMs und EHTs mit unterschiedlichen Zellkonzentrationen in ein Rattenmodell injiziert bzw. implantiert und gemessen.
Ergebnisse
Nach dem Knock-in zeigten die hiPSCs ein positives Biolumineszenz Signal. Die Genotypisierung der hiPSCs zeigte die Integration des Gens. FACS-Analysen und histologische Untersuchungen von Luc+ hiPSCs (78,88 ± 3,85, n=6) wiesen einen gleichen Pluripotenz-Charakter im Vergleich zu Luc- hiPSCs (87,8% ± 2,46, n=6). Sowohl Luc- KMs (70,1% ± 4,96, n=6) als auch Luc+ KMs (72% ± 7,36, n=6) zeigten ein positives Signal für Troponin-T. Verdünnungsreihen von hiPS-KMs (R2=0,97) und EHTs (R2=0,99) zeigten eine starke Korrelation zwischen Zellzahl und Signalintensität. Durch video-optische Analysen konnten sowohl für Luc- EHTs als auch für Luc+ EHTs ein regelmäßiges und sich gleichendes Kontraktionsprofil erstellt werden. Die In-vitro-Analyse von Luc+-Zellen zeigte die Nachweisgrenze durch das BLI von etwa 10 Zellen (6,3x10^4 p/s/cm2/sr) im Vergleich zur Kontrolle (keine Zellen) (5,2x10^4 p/s/cm2/sr). Verdünnungsreihen von hiPS-KMs, die in ein Rattenmodell implantiert wurden, zeigten unterschiedliche Abschirmungen für jedes Organ (Herz=1,15x10^6 p/s/cm2/sr, Lunge=1,1x10^6 p/s/cm2/sr, Leber=1,75x10^6 p/s/cm2/sr, Niere=2,42x10^6 p/s/cm2/sr) und eine Nachweisgrenze von < 10.000 Zellen durch das BLI.
Zusammenfassung
Diese Studie zeigt, dass das Biolumineszenz-Imaging von lentiviral transduzierten hiPSCs geeignet ist, lebende Zellen - auch kleine Zellzahlen - mit hoher Empfindlichkeit zu detektieren. Der Knock-in von hiPSCs mit dem Reporterenzym Luciferase zeigte keine negativen Auswirkungen auf den Pluripotenz-Charakter und die Differenzierungsfähigkeit von hiPSCs in hiPS-KMs. Des weiteren konnte gezeigt werden, dass sich die Luc+ hiPS-KMs dazu eignen spontan kontrahierende EHTs herzustellen und sich ein regelmäßiges Kontraktionsprofil dieser EHTs erstellen lässt.