1Herzzentrum der Universität zu Köln Klinik III für Innere Medizin Köln, Deutschland; 2Università degli Studi di Torino Torino, Italien; 3Herzzentrum der Universität zu Köln Klinik für Kardiologie, Angiologie, Pneumologie und Internistische Intensivmedizin Köln, Deutschland
Rationale Pulmonale Hypertonie (PAH) ist eine pulmonal-vaskuläre Erkrankung, die durch Vasokonstriktion und vaskuläres Remodeling in pulmonalen Arteriolen charakterisiert ist. Eine verstärkte Aktivierung Rezeptor Tyrosin Kinase (RTK) vermittelter Signalwege führt zu einer erhöhten Proliferation und Chemotaxis pulmonal arterieller glatter Gefäßmuskelzellen (PASMCs), sowie von pulmonalen Endothelzellen (EC). In bisherigen Untersuchungen konnten wir mit Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K) ein Schlüsselenzym für diese Prozesse identifizierten. Da bei einer systemischen PI3K Inhibition potentiell mit Nebenwirkungen zu rechnen ist, wurden hier die Effekte des neuartigen PI3K-Inhibitors Cgn auf Wachstumsfaktor-vermittelte zelluläre Effekte in murinen und humanen PASMCs, sowie murinen ECs untersucht. Cgn wird als Prodrug erst intrazellulärer aktiviert und bietet dadurch eine optimale Wirksamkeit in den Zielzellen bei zugleich Minimierung unerwünschter Effekte in Nicht-Zielzellen.
Methoden Zur Quantifizierung der Effekte auf die Zellproliferation wurde die DNA-Synthese mittels eines 5-Bromo-2-deoxyuridin (BrdU)-Inkorporations-Assays analysiert. Zu diesem Zweck wurden PASMCs, sowie ECs mit Cgn [0,1; 0,3; 1; 3; 10µM] vorbehandelt und entweder mit PDGF-BB [30ng/ml] alleine oder mit einer Kombination verschiedener Wachstumsfaktoren (PDGF-BB 30ng/ml, FGF 2ng/ml, EGF 0,5 ng/ml, Insulin 0,5µg/ml, FCS 5% bzw. VEGF 50ng/ml, FCS 5%) stimuliert. Entsprechend wurde Chemotaxis mit Hilfe modifizierter Boyden Kammern sowie die Signaltransduktionskaskade mittels Western Blotting untersucht.
Ergebnisse Die Untersuchung der mitogenen Signaltransduktions-Wege in PASMCs ergab eine deutlich reduzierte Phosphorylierung von AKT (Threonin 308 und Serin 473) und GSK3ß in Cgn vorbehandelten Zellen. Darüber hinaus wurden zentrale Ereignisse des Zellzyklus wie die Expression von Cyclin D1 vermindert, was mit einer Cgn konzentrationsabhängigen signifikanten Reduktion der Proliferation nach Stimulation mit PDGF (human:2,53 ± 0,26 vs 0,73 ± 0,14 bei 10µM, p<0,001; murin:3,6 ± 0,51 vs 1,87 ± 0,54 bei 10µM, p<0,001) bzw. mit verschiedenen Wachstumsfaktoren (human: 5,27 ± 0,61 vs 2,80 ± 0,71 bei 10µM, p<0,05; murin:6,27 ± 0,74 vs 6,05 ± 0,59) einherging. Die Chemotaxis wurde ebenfalls signifikant gehemmt (PDGF human:100% ± 19 vs 24,43% ± 8,58 bei 10µM p<0,05; murin:100% ± 9,81vs 30,36% ± 8,72 bei 10µM p<0,01; Wachstumsfaktor Kombination human: 100% ± 5,76 vs 25,23% ± 10,57 bei 10µM p<0,001; murin:100% ± 8,01 vs 53,81% ± 7,814 bei 10µM p<0,01). In murinen ECs konnten ebenfalls sowohl die Proliferation, als auch die Chemotaxis reduziert werden (Proliferation mit Wachstumsfaktor Kombination: 16,18 ± 2,02 vs 12,09 ± 1,68 Chemotaxis mit Wachstumsfaktor Kombination:100% ± 3,14 vs 18,97 ± 2,78 bei 10µM p<0,01)
Schlussfolgerung Diese Ergebnisse zeigen, dass die PI3K Inhibition mittels Cgn sowohl die Proliferation als auch Chemotaxis von PASMCs und ECs vermindert. Da diese Prozesse maßgeblich an der Entstehung und Progression der PAH beteiligt sind, wird dieser Ansatz aktuell in verschiedenen präklinischen Modellen hinsichtlich seines therapeutischen Potentials untersucht. Mit Hilfe dieses „Prodrug“-Ansatzes könnten „off-target“ Effekte und systemische Nebenwirkungen einer Pan-PI3K-Inhibition vermieden werden, zumal die Substanz auch für eine topische Anwendung (z.B. Inhalation) geeignet ist. Damit könnte Cgn eine interessante Option für Reverse-Remodeling-Strategien bei PAH darstellen.